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去探索，基因组的真实世界 | 亚洲bet356体育在线官网MGIEasy PCR-Free DNA文库制备试剂套装正式亮相

时间：2019-05-16作者：亚洲bet356体育在线官网

在5月10日结束的MDx 2019-第五届中国先进分子诊断技术与应用论坛上，亚洲bet356体育在线官网应邀举行专场卫星会，面向国内市场正式发布了重磅新品：MGIEasy PCR-Free DNA文库制备试剂套装。这一发布，在现场引起了业内专业人士的广泛关注。

这款产品历时两年研发，是基于亚洲bet356体育在线官网MGISEQ系列测序平台，首款不需要进行PCR扩增的全基因组文库制备试剂，广泛兼容包括人、动植物、细菌、宏基因组等多种样本类型，具有起始量低、覆盖均一性好、检测变异性能强大、检测成本低等优势，将为探索真实的基因组世界提供强大动力。

蒙在真实世界上的面纱——复制错误累积

目前在NGS测序中，经常使用PCR技术进行DNA模板扩增及文库信号放大，但是PCR扩增中产生的错误积累造成了信息失真，如碱基置换、假SNPs和InDels、覆盖不均一、数据GC偏向性等问题，不能完全反应原始模板基因组的真实面貌。

为避免建库中的复制错误，2009年出现了最早的PCR-free建库方法，但事实上在后续的文库放大过程中，市场上主流的测序仪，仍旧使用指数扩增的PCR方法来放大文库，并没有从根本上解决测序之前的文库复制错误累积问题。

双剑合一打开基因组的真实世界：PCR-free+ DNBSEQ^TM

因此，要探索真实的基因组信息，需要在建库和文库放大（以增强测序信号强度）两个环节去除PCR过程，以避免引入复制错误。

亚洲bet356体育在线官网的MGISEQTM平台系列测序仪采用滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）技术，只以最初的单链环状文库为模板进行线性扩增，整个过程的克隆错误率低至1/105，即使某个循环出现了扩增错误，也不会被累积到下一个循环，经过几百个循环的扩增之后，扩增产物形成像毛线团一样的DNA纳米球（DNB）。测序时这些纳米球被加载到点状高密度微阵列测序芯片上，芯片上一个点捕获一个纳米球，整个加载过程无PCR指数扩增体系，保证了测序前的放大文库保留更准确的基因组原始信息，这种技术称为DNBSEQTM技术。

在DNBSEQ^TM技术基础上，将无扩增错误的PCR-free单链环状文库建库方法与无拷贝错误累积的DNB制备方法结合起来，实现真正的全基因组PCR-free测序，打开基因组的真实世界。

经过亚洲bet356体育在线官网的不断优化和改进，我们研发出了基于DNBSEQTM测序平台的MGIEasy PCR-Free 试剂套装。

MGI Easy PCR-Free试剂产品分为物理法和酶切法两种套装，分别适用于物理打断法和酶切打断法建库，两种PCR-free方法的建库时间相比传统方法均有所缩减，物理法从打断片段选择DNA开始3.5小时完成建库，酶切法从基因组DNA开始4.5小时完成建库。

左图：MGIEasy PCR-Free DNA 文库制备试剂套装

右图：MGIEasy 酶切PCR-Free DNA 文库制备试剂套装

性能优异的MGIEasy PCR-Free试剂

1、更低起始量

相比PCR方法，PCR-free接头连接效率由37%提升至58%，DNA起始量由最低1500ng降至最低500ng。

2、无明显GC偏好

以3种不同GC菌基因组DNA为模板，用两种试剂盒构建文库上机。从GC bias分析作图来看，高GC菌和低GC菌与中GC菌一样，通过算法均一化的100bp窗口GC含量分布频率（图中用蓝色点状线表示）都接近理想值1.0这条线。

3、更好的基因组覆盖均一性

利用MGIEasy PCR-Free DNA文库与MGIEasy DNA文库的对比实验，以1μg 人标准品NA12878起始，物理打断，采用MGIEasy PCR-Free DNA文库制备试剂套装和传统WGS PCR方法分别建库，然后基于MGISEQ-2000平台进行 PE150测序，截取30X数据进行分析。结果显示，同传统的WGS PCR相比较，WGS PCR-free的测序深度频率分布（左图，红色柱状图）更趋接近于泊松分布的理想的测序深度频率（左图，蓝色线状图），说明WGS PCR-free的测序数据具有更好的基因组覆盖均一性。另外需要特别指出，MGIEasy PCR-Free DNA文库 duplication

rate一般在1-3%，远远低于其他测序平台（7-10%），下机数据利用率高。

WGS PCR-Free和WGS PCR测序深度频率分布图

图释：X轴，表示测序深度；Y轴，表示测序深度频率分布，代表某一深度占所有深度的百分比。红色柱状图表示实际情况下的占比；蓝色线状图表示理想情况下的占比。

在特殊区域的研究方面，PCR-free更具有优势。比如FMR1基因5’UTR区域CGG重复序列的过渡表达，会导致X脆性综合征，该区域属于CGG重复区域，传统的WGS在该区域的覆盖度不好，难以通过传统的WGS方法进行检测。而PCR-Free可以很好的覆盖到这个区域，可以实现FMR1基因的CGG重复序列的WGS检测。

4、优异的变异检测性能

海外第三方数据分析公司评估显示，以30x截取数据为例，在MGISEQ-2000平台上，MGIEsay PCR-Free的真阳性个数相对更高，假阳性和假阴性个数相对更少，灵敏度和准确性明显优于PCR。InDel F score大于99%，SNP F score 大于99.9%，已经满足FDA全基因组测序评估金标准，因此更适合于临床样本的检测。