尽管基于测序的空间转录组技术（sequencing-based spatial transcriptomics，简称sST）显著促进了生物学领域在空间基因表达测量方面的进步，但由于技术和数据集之间的差异性，该领域目前仍缺乏全面的基准测试研究。2024年7月4日，广州实验室田鲁亦团队和西湖大学刘晓东团队联合墨尔本大学、哈佛大学等研究团队在Nature Methods发表了一篇题为“Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods”的研究成果。

该研究通过系统地比较11种sST方法，并利用小鼠胚胎、眼睛和大脑海马区等参考组织生成了跨平台数据集（cadasSTre），来评估这些技术在空间分辨率、捕获效率和分子扩散方面的性能。研究揭示了不同sST技术在下游应用中展现的不同能力，并强调了sST数据中基因检测偏差的存在。本研究旨在为研究人员在sST平台选择方面提供指导，促进评估标准的共识，并为空间转录组数据分析计算工具的开发和基准测试工作建立框架。

文章题目：Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods

发表时间：2024-07-04

发表期刊：Nature Methods

主要研究团队：广州实验室、西湖大学、墨尔本大学、哈佛大学等

影响因子：36.100

DOI：10.1038/s41592-024-02325-3

主要研究结果

01

基准测试参考组织和实验设计

对 11 种 sST 方法进行了全面比较（包括 10X Genomics Visium（基于 poly-A 和基于探针的两种方法）、DynaSpatial、HDST、BMKMANU S1000、Slide-seq V2、Curio Seeker（Slide-seq 的商业版本）、Slide-tag、Stereo-seq、PIXEL-seq、Salus 和 DBiT-seq）。发现每种技术都有其独特的策略，并在不同的组织样本中展现出不同的性能。

Stereo-seq（时空组学技术）的点中心距离小于10 μm，显示了其卓越的空间分辨率。不仅如此，Stereo-seq能够捕获几乎整个组织区域，如成年小鼠的大脑和E12.5小鼠胚胎，表明其广泛的捕获能力。此外，Stereo-seq在小鼠胚胎组织上展现出了出色的扩散控制性能，为研究者提供了准确可靠的数据基础。

相比之下，Slide-seq V2受限于捕获面积较小，只能捕获组织的一部分；而DBiT-seq的捕获面积受微流控通道宽度限制，且存在跨通道污染的风险。尽管HDST和BMKMANU S1000也表现出较好的捕获能力，但Stereo-seq表现出了最高的捕获能力，其常规阵列大小为1cm，最大尺寸可达13.2cm，成为研究细胞间转录组空间分布和相互作用的理想工具。

实验设计概述与数据处理流程

02

分子捕获效率

在评估不同sST方法的分子捕获效率时，研究发现Stereo-seq在测序深度上显著超越其他平台，特别是在小鼠海马体和眼部的分析中，Stereo-seq在同一区域内产生了更多的测序读数，从而在总计数上表现优异。然而，在控制测序深度后，Slide-seq V2在小鼠眼部和基于探针的Visium、DynaSpatial在海马体中展现出更高的灵敏度。

Stereo-seq的优势在于其能够生成大量的测序数据，这对于需要高灵敏度和深度解析的研究尤为重要。尽管Visium(probe)在某些情况下（如小鼠眼部）也表现出高灵敏度，但Stereo-seq在测序深度和潜在的信息捕获能力上更为突出。此外，Stereo-seq数据的分析结果显示，每个点的计数和特征数量之间的关系在下采样后更为显著，进一步强调了其在处理复杂样本时的潜力。

不同平台生成数据的敏感性比较

03

分子侧向扩散

在评估不同空间转录组测序技术在mRNA空间准确性方面的性能时，通过对比Stereo-seq、Slide-seq V1.5/V2、PIXEL-seq和BMKMANU S1000等技术在不同组织（嗅球、大脑、眼组织）中利用标记基因（Slc17a7、Ptgds和Pmel）的表现，发现Stereo-seq在眼组织中对侧向扩散的控制尤为出色。

虽然Stereo-seq在嗅球和大脑组织的侧向扩散控制方面存在不足，但在眼组织中其控制能力明显优于其他技术。这表明Stereo-seq在某些特定组织类型中可能具有独特的优势，能够为研究者提供更准确的mRNA空间分布信息。

然而，值得注意的是，下采样并不能解决Stereo-seq数据中的侧向扩散问题，这可能与该技术原理或实验操作相关。因此，在选择适合特定研究的空间转录组测序技术时，研究人员需要综合考虑组织类型、实验需求和技术特点。

不同平台生成数据的扩散比较

04

聚类和细胞注释

在研究E12.5小鼠眼睛内部细胞状态复杂性的过程中，Stereo-seq在细胞亚群识别方面也表现出了显著的优势。为了识别出更详细且一致的细胞亚群，分别利用Seurat、DR.SC和PRECAST等软件的聚类方法，对各sST平台捕获的数据进行注释，发现Stereo-seq和Slide-seq V2在全面亚群注释方面表现突出，能够成功捕获所有预期的细胞亚群。

Stereo-seq不仅提供了良好的细胞亚群分离，还以其高捕获灵敏度和对侧向扩散的有效控制，在识别复杂细胞亚群时表现尤为出色。相比之下，BMKMANU S1000在检测细胞状态，特别是识别黑色素细胞时面临挑战，可能与数据中的侧向扩散问题有关。而Visium技术则因其较低的物理分辨率和有限的捕获位点数量，在检测预期细胞亚群时受到限制。

聚类和注释性能比较

05

不同技术之间的标记基因检测 

在评估不同空间转录组测序（sST）技术的性能时，Stereo-seq技术凭借其独特的优势在识别特定细胞类型标记基因方面表现突出。通过Wilcoxon秩和检验在Seurat中进行标记基因识别，Stereo-seq在识别如Pax6、Hes和Sox2等关键基因时，展现了技术特异性偏差下的独特准确性。特别是在识别pNR3集群中的Pax6表达时，Stereo-seq显示出了其他技术（如Slide-seq V2和BMKMANU S1000）无法比拟的准确性，这体现了Stereo-seq在特定细胞类型标记基因识别方面的独特优势。

进一步的下采样数据分析表明，测序读取量较少的细胞亚群，仍可被Stereo-seq技术轻松识别，并且Stereo-seq技术在处理具有相似表达谱的细胞亚群时，依然能保持较高的区分度，这进一步强化了其在细胞亚群识别方面的优势。

尽管不同sST技术在基因检测方面各有特点，可以相互补充，但Stereo-seq在特定细胞类型标记基因识别方面的准确性无疑为其赢得了显著的优势。此外，尽管在细胞间通信分析方面，不同sST方法和通信方法（如CellChat和CellPhoneDB v4）未获得一致结果，但这为未来的技术优化和发展提供了方向。

研究总结

在这项研究中，研究者创建了一个名为cadasSTre的跨平台数据集，旨在对基于测序的空间转录组（ST）方法进行基准测试。通过对11种sST方法在实验中的系统评估，深入比较了这些方法的灵敏度、扩散性、聚类能力和标记基因检测等关键性能指标。

研究结果显示，Stereo-seq展现了卓越的捕获效率，这一优势使得其在数据质量和信息获取方面脱颖而出。与此同时，尽管所有sST方法都面临测序成本高昂和难以达到数据饱和水平的挑战，Stereo-seq在提供高质量数据方面的效率尤为显著。

此外，研究者还在Visium平台上观察到了意外的基因捕获偏差，而Stereo-seq在多个组织类型中则展现了更稳定和一致的捕获效果。这一发现进一步增强了Stereo-seq在空间转录组学领域的应用潜力。

在评估空间分辨率时，研究者认识到捕获位点大小虽然是一个重要指标，但扩散性对实际分辨率的影响更为关键。Stereo-seq在小鼠胚胎组织上展现了出色的扩散控制，表明其在某些组织类型中具有较高的分辨率。然而，研究者也注意到Stereo-seq在小鼠大脑组织中存在较强的扩散，提示不同组织类型可能需要特定的优化条件以充分发挥Stereo-seq的性能。

sST方法的结果与特性概述

sST方法根据其在特定类别中的性能进行了排名，最佳方法位于顶部。排名通过颜色和斑点大小在左侧面板中直观展示，而右侧面板则概述了这些方法的关键特性，包括“设置复杂度”，即构建每种方法的难易程度。

本研究是全球首个并且规模最大的空间组学技术的系统比较，并且建立了完整的评估方案，包括标准品的建立，实验流程，数据分析流程，具体指标等等，并且全部公开可重复。通过评估，一些国产的技术平台的指标已经达到领先，凸显了中国在这一新兴领域的快速发展趋势。该比较研究将在网站上https://genographix.com/home持续更新。